1 范围
本部分描述了大鳞大麻哈鱼胚胎细胞系(chinook salmon embryo cell line，CHSE)的形态、传代培养条件、生长特性、针对部分水生动物病毒的敏感谱及传代细胞的质量控制。
本部分适用于大鳞大麻哈鱼胚胎细胞系的培养、使用和保藏。
2 规范性引用文件
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GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
3 术语和定义
3.1 大鳞大麻哈鱼胚胎细胞系chinook salmon embryo cell line,CHSE
Lannan C N.、Winton J.R和Fryer J.L 1984年从大鳞大麻哈鱼(Oncorh ynchus kisutch)的胚胎细胞经原代培养、衍生的连续细胞系。
4 细胞的形态、大小与特性
4.1 形态
为上皮样细胞(参见图A.1)。
4.2 大小
经细胞实时分析系统测定细胞悬浮后的平均直径约10.71μm，其中最大量细胞的峰值直径约9.52μm(参见B.2)。
4.3 特性
4.3.1 生长特性
贴壁生长。
4.3.2 对部分水生动物病原的敏感性
CHSE对流行性造血器官坏死病毒(Epizootie haematopoietic necrosis virus，EHNV)、传染性胰脏坏死病毒(Infectious pacreatic necrosis virus，IPNV)等病毒敏感，接种后的CPE形态参见附录A。
5 主要材料与仪器设备
5.1 水
应符合GB/T 6682中一级水的规定。
5.2 细胞培养液
主要成分见C.1。
5.3 细胞消化液
主要成分及其含量见C.2。
5.4 血清
胎牛血清。
5.5 仪器设备
主要包括：
——生化培养箱、超净工作台、真空泵和废液瓶等培养细胞所用的设备；
——倒置显微镜；
——血球计数板或电子细胞计数仪；
——细胞培养瓶、移液器或洗耳球以及移液管等培养细胞所用的耗材。
6 细胞培养条件
6.1 培养温度
细胞置于生化培养箱内，在15℃～22℃下培养，最适生长温度为20℃。
6.2 培养液pH
7.2～7.6。
7 细胞传代与保藏
7.1 传代程序
7.1.1 吸弃旧培养液
置于超净工作台内，无菌环境下吸弃长满单层CHSE细胞培养瓶中的旧培养液。
7.1.2 消化细胞
用细胞消化液消化分散细胞。沿细胞培养瓶一侧加入细胞消化液，一般在50 mL细胞培养瓶中加入5 mL左右或按细胞培养瓶培养面每平方厘米加入0.1 mL～0.2 mL，加入量必须完全浸没细胞层。贴壁长满的CHSE消化时间一般为1.5 min～5 min，细胞开始呈雾状之后吸弃细胞消化液，轻轻拍打培养瓶以分散细胞。
7.1.3 更换细胞培养液与分瓶
将消化液吸弃后，在50 mL细胞培养瓶中，加入10 mL～15 mL细胞培养液(C.1)，按每瓶5 mL分成2瓶～3瓶，使细胞终浓度达到1×105个/mL。分瓶后在20℃下培养，18 h内细胞贴壁并生长；24 h后能基本长满单层细胞。不同规格的细胞培养瓶，按培养面每平方厘米加入0.1 mL～0.2 mL的细胞培养液。
7.1.4 细胞的传代周期
细胞长满单层5 d后再次传代较好。
7.2 细胞的保藏
7.2.1 保藏条件
7.2.1.1 温度与天数
传代后的CHSE经20℃ 24 h的培养后，移入生化培养箱15℃或20℃保藏。在15℃下可保存45 d以上，20℃下可保存30 d以上。
7.2.1.2 保藏液pH
7.2～7.6。
7.2.2 液氮冻存
保种也可在液氮中冻存。细胞冻存液中需要加入10%二甲基亚砜(DMSO)作为保护剂，其胎牛血清浓度应为20%，保种细胞应经程序降温后放入液氮中。
8 传代细胞的质量检查
传代细胞的质量检查包括：
——培养的CHSE，依4.3.2在一年内至少要进行一次病毒敏感谱的检测，其接种后的CPE形态参见附录A；
——在移入生化培养箱的第二天用倒置显微镜观察细胞形态、生长情况，并连续观察7 d～10 d；
——可按培养液中酚红的颜色判定培养液的pH是否保持在7.2～7.6；
——细胞培养液混浊或出现丝状物时，视为细菌或真菌污染。
附 录 A
(资料性附录)
CHSE及其接种病毒产生的CPE形态图
A.1 长满单层正常的CHSE见图A.1。
图A.1 长满单层正常的CHSE
A.2 CHSE在接种IPNV后出现的CPE见图A.2。
图A.2 CHSE在接种IPNV后出现的CPE
A.3 CHSE在接种EHNV后出现的CPE见图A.3。
图A.3 CHSE在接种EHNV后出现的CPE |